Wenn Sie jemals Zeit damit verbracht haben, digitale Pathologie-Objektträger zu analysieren oder Forschungsproben abzubilden, haben Sie sich wahrscheinlich gefragt, wie ein Mikroskop-Objektträger-Scanner jedes Detail mit solch einer Präzision erfasst – selbst wenn der Objektträger geringfügige Höhenunterschiede oder winzige Unvollkommenheiten aufweist, die den Fokus einer Standardkamera beeinträchtigen würden. Als Lieferant von leistungsstarken digitalen Diascannern wird mir diese Frage ständig gestellt, und sie ist einer der wichtigsten Gründe dafür, warum unsere Geräte Tag für Tag zuverlässige und konsistente Ergebnisse liefern. Lassen Sie uns genau erläutern, wie der Fokussierungsmechanismus funktioniert, warum er für verschiedene Anwendungsfälle wichtig ist und wie unsere Scanner so konstruiert sind, dass sie in diesem Bereich hervorragende Leistungen erbringen.
Beginnen wir zunächst mit den Grundlagen: Objektträger sind nicht vollkommen flach. Ein Standardobjektträger aus Glas ist etwa 1 mm dick, aber darauf werden biologische Proben (wie Gewebeschnitte, Zellkulturen oder zytologische Präparate) montiert, deren Höhe um 10 bis 50 Mikrometer variieren kann – manchmal auch mehr, je nachdem, wie die Probe vorbereitet wurde. Selbst geringfügiger Staub oder Schmutz auf dem Objektträger fügt kleine, unerwartete Schichten hinzu. Damit ein Scanner ein scharfes Bild erfassen kann, muss sich sein Fokus kontinuierlich anpassen, während er sich über das Objektträger bewegt, und zwar schneller, als ein menschliches Auge blinzeln kann, und dabei eine Genauigkeit im Bruchteil eines Mikrometers beibehalten. Das ist keine Kleinigkeit.
Die meisten Mikroskop-Objektträgerscanner verwenden eine von zwei Kernfokussierungstechnologien: passiver Autofokus (AF) oder aktiver AF, und viele High-End-Modelle kombinieren beide, um das Beste aus beiden Welten zu erhalten. Beginnen wir mit dem passiven AF, denn diesen haben wir in unsere Einsteiger-Hellfeldscanner wie den Brightfield Slide Scanner EScan-1200 eingebaut. Passiver AF gibt kein externes Signal aus; Stattdessen analysiert es das vom Objektträger reflektierte Licht, um festzustellen, wo der schärfste Fokus liegt. Die Software des Systems prüft den Kontrast des Bildes in kleinen Fenstern, während der Scanner das Objektiv auf und ab bewegt. Wenn der Kontrast am höchsten ist, ist dies der Punkt der scharfen Fokussierung. Bei Hellfeldanwendungen, bei denen Proben mit Farbstoffen angefärbt werden, die deutliche Hell-Dunkel-Unterschiede erzeugen, funktioniert dies sehr gut. Es ist schnell genug, um Hellfeld-Dias mit 20- oder 40-facher Vergrößerung zu scannen, und es senkt die Kosten für Labore, die keine Fluoreszenzbildgebung benötigen. Aber passiver AF hat seine Grenzen – wenn ein Objektträger einen sehr gleichmäßigen Bereich mit geringem Kontrast aufweist (z. B. eine klare Glaskante oder eine dünne, nicht gefärbte Probe), kann die Software Kontrastunterschiede nicht erkennen und es kann zu einer Fokusverschiebung kommen.
Hier kommt der aktive AF ins Spiel, und das ist die Technologie, die wir für forschungstaugliche Scanner, wie unseren forschungstauglichen Fluoreszenz-Objektträgerscanner, priorisieren. Aktiver AF verwendet einen separaten Sensor oder eine Lichtquelle, um ein Signal auf den Objektträger zu projizieren und misst dann, wie dieses Signal zurückreflektiert wird, um den genauen Abstand vom Objektiv zur Probe zu berechnen. Die beiden häufigsten Arten von aktivem AF, die in Diascannern verwendet werden, sind Lasertriangulation und auf chromatischen Aberrationen basierende Fokussierung. Die Lasertriangulation ist einfacher: Ein Infrarot-Laserstrahl geringer Leistung wird auf den Objektträger gerichtet und ein Kamerasensor erkennt, wo der Laserpunkt auf dem Objektträger landet. Wenn der Schieber zu nah oder zu weit entfernt ist, bewegt sich der Punkt auf dem Sensor und der Scanner passt die Position des Objektivs an, um den Punkt wieder an den idealen Punkt zu bringen. Dies funktioniert sogar bei Proben mit geringem Kontrast, da es sich um die Messung der physischen Entfernung und nicht um den Lichtkontrast handelt. Bei der Fokussierung der chromatischen Aberration wird eine Lichtquelle verwendet, die in verschiedene Farbwellenlängen aufspaltet; Jede Wellenlänge fokussiert auf einen leicht unterschiedlichen Abstand, daher vergleicht der Scanner, wie jede Farbe vom Objektträger reflektiert wird, um den Fokus zu berechnen. Dies ist besonders nützlich für Fluoreszenzobjektträger, die einen noch geringeren Kontrast als Hellfeldproben aufweisen können, da Fluorophore Licht emittieren, anstatt es zu reflektieren.
Viele unserer Scanner, wie der Digital Pathology Slide Scanner, verwenden ein Hybrid-AF-System, das passiven und aktiven AF kombiniert, um tote Winkel zu beseitigen. So funktioniert es: Wenn der Scanner zum ersten Mal ein Dia lädt, nutzt er den aktiven AF, um das Höhenprofil des gesamten Dias innerhalb der ersten 10 Sekunden abzubilden. Dadurch wird eine „topografische Karte“ der Rutsche erstellt, auf der alle Unebenheiten, Senken und Abweichungen markiert sind. Während sich der Scanner dann über das Dia bewegt und Bilder aufnimmt, verwendet er den passiven AF, um den Fokus schnell für jedes einzelne Sichtfeld anzupassen. Die vorinstallierte Karte wird nur dann verwendet, wenn er auf Bereiche trifft, in denen der passive AF Probleme bereiten würde. Dieser Hybridansatz verkürzt die Scanzeit und stellt gleichzeitig sicher, dass selbst schwierige Proben, wie z. B. in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte mit dicken, unebenen Abschnitten, im gesamten Bild scharf bleiben.
Ein weiterer wichtiger Teil des Fokussiermechanismus ist der Piezomotor, der das Objektiv oder den Tisch tatsächlich bewegt, um den Fokus einzustellen. Piezomotoren werden anstelle von Standard-Schrittmotoren verwendet, weil sie schneller und präziser sind: Sie können die Position in Nanosekunden anpassen, mit einer Genauigkeit von bis zu 10 Nanometern – viel kleiner als das kleinste Detail einer Gewebeprobe. Für das Scannen mit hoher Vergrößerung (wie 60x oder 100x, was in der Forschungspathologie üblich ist) ist diese Präzision nicht verhandelbar. Wenn der Fokus auch nur um 0,5 Mikrometer abweicht, wird das Bild unscharf und Sie übersehen kleine Strukturen wie Zellkerne oder Proteinmarkierungen. Unser Mehrkanal-Fluoreszenz-Objektträgerscanner verwendet ein Piezomotorsystem, das über 1.000 Fokuseinstellungen pro Sekunde vornehmen kann, was bedeutet, dass er einen 40-fachen Fluoreszenzobjektträger in der Hälfte der Zeit eines Scanners mit Schrittmotor scannen kann, ohne dabei an Schärfe zu verlieren.
Moment, aber was ist mit Fällen, in denen die Proben dick sind? Einige biologische Proben, wie Ganzkörper-Organismus-Objektträger oder 3D-Zellkulturen, sind Dutzende Mikrometer dick – sodass nicht einmal eine einzelne Schicht alle Details erfassen kann. Hier kommt die Z-Stacking-Funktion unserer Scanner ins Spiel, die direkt mit dem Fokussierungsmechanismus verknüpft ist. Anstatt einmal pro Sichtfeld zu fokussieren, erfasst der Scanner 3 bis 5 Bilder auf unterschiedlichen Fokusebenen und fügt sie dann zusammen, um ein einziges, scharfes Bild zu erstellen, das alle Schichten der Probe umfasst. Für Forschungsanwendungen ist dies von entscheidender Bedeutung, um die 3D-Struktur von Geweben zu untersuchen oder mehrere Fluoreszenzmarker gleichzeitig zu lokalisieren. Unser digitaler Pathologiescanner GScan-60 verfügt über einen Z-Stacking-Modus, der den Fokus in 2-Mikrometer-Schritten anpasst, sodass Ihnen in dicken klinischen Proben kein Detail entgeht.
Ich habe aus erster Hand gesehen, wie eine schlechte Fokussierung die Forschungs- oder Diagnosearbeit eines Labors zum Scheitern bringen kann. Ein Kollege von mir in einem kleinen Pathologielabor erzählte mir einmal, dass sie einen günstigeren Objektträgerscanner verwenden würden, der den Fokus auf die Kanten der Objektträger verlieren würde und ihre Pathologen dazu zwingen würde, 20 % der Bilder manuell anzupassen. Das verschwendete Stunden und führte zu Verzögerungen bei der Patientendiagnose. Als sie auf unsere Scanner umstiegen, reduzierte das Hybrid-AF-System die manuellen Anpassungen auf weniger als 1 % und die Scanzeit verkürzte sich um 30 %. Das ist der wahre Wert eines gut konzipierten Fokussiermechanismus – es geht nicht nur darum, ein klares Bild zu erhalten; Es geht darum, Zeit zu sparen, menschliche Fehler zu reduzieren und genauere Ergebnisse zu ermöglichen.
Es gibt ein paar verbreitete Mythen über die Fokussierung von Diascannern, mit denen ich ebenfalls aufräumen möchte. Manche Leute denken, dass eine höhere Vergrößerung bedeutet, dass man ein komplizierteres Fokussierungssystem benötigt, aber es kommt weniger auf die Vergrößerung als vielmehr auf die Art der Probe an. Beispielsweise muss ein 40-fach vergrößerter Hellfeld-Objektträger einer gefärbten Gewebeprobe präzise fokussiert werden, ein 20-fach vergrößerter Objektträger mit Zellkulturen auf einem Flachglasobjektträger könnte jedoch mit passivem AF gut funktionieren. Andere Mythen: Der aktive AF sei immer langsamer als der passive AF. Mit modernen Piezomotoren ist der aktive AF tatsächlich schneller, da er nicht mehrere Positionen scannen muss, um den schärfsten Kontrast zu finden, sondern die Entfernung direkt berechnet.
Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Fokussierung ist die Kalibrierung. Selbst der beste Fokussiermechanismus funktioniert nicht, wenn er nicht regelmäßig kalibriert wird. Unsere Scanner verfügen über automatische Kalibrierungsroutinen, die jedes Mal ausgeführt werden, wenn Sie einen neuen Objektträgertyp laden. Bei Bedarf stellen wir Ihnen Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die manuelle Kalibrierung zur Verfügung. Wir legen jedem Scanner auch Testobjektträger bei, damit Labore überprüfen können, ob der Fokus korrekt ist. In Forschungsumgebungen, in denen die Konsistenz aller Experimente von entscheidender Bedeutung ist, stellt diese Kalibrierung sicher, dass Bilder aus verschiedenen Scans vergleichbar sind, auch wenn sie mehrere Monate auseinander liegen.
Lassen Sie uns nun darüber sprechen, wie wir unsere Fokussierungsmechanismen so gestalten, dass sie den unterschiedlichen Kundenanforderungen gerecht werden. Ein Forschungslabor, das Fluoreszenzobjektträger scannt, benötigt ein Fokussierungssystem, das mehrere Fluorophore verarbeiten kann, die unterschiedliche Emissionswellenlängen haben können. Unser Fluoreszenz-Objektträgerscanner in Forschungsqualität ist mit einem Sensor ausgestattet, der unterschiedliche Lichtwellenlängen berücksichtigt, sodass der Fokus gleich bleibt, egal ob Sie DAPI- (blau), FITC- (grün) oder Texas Red- (rot) Kanäle scannen. Für digitale Pathologielabore, die täglich Hunderte von Objektträgern verarbeiten, ist Geschwindigkeit von entscheidender Bedeutung – das Hybrid-AF-System unseres GScan-60 kann einen ganzen Objektträger in weniger als 5 Minuten scannen, und der Fokussierungsmechanismus wird über Tausende von Scans nicht ungenauer, da wir langlebige Komponenten in Industriequalität verwenden.
Ich habe auch Kunden gefragt, ob sie sich auf nasse Objektträger konzentrieren möchten, beispielsweise Objektträger mit Live-Cell-Imaging. Unsere Scanner können nasse Objektträger verarbeiten, wir empfehlen jedoch die Verwendung des aktiven AF-Modus, da nasse Proben Oberflächenreflexionen aufweisen können, die den passiven AF verwirren. Der laserbasierte aktive AF kann die dünne Flüssigkeitsschicht auf dem Objektträger durchdringen und auf die Probe selbst fokussieren, was für Labore, die Zeitrafferaufnahmen von Zellkulturen durchführen, ein großer Vorteil ist.
Letztendlich ist der Fokussiermechanismus der unbesungene Held des Mikroskop-Objektträgerscanners. Es handelt sich um den Teil, der hinter den Kulissen arbeitet und einen verschwommenen Glasobjektträger in ein scharfes, detailliertes digitales Bild verwandelt, das Forscher analysieren, Pathologen für die Diagnosestellung nutzen können und auf das sich Kliniker bei Behandlungsplänen verlassen können. Ganz gleich, ob Sie ein kleines Diagnoselabor, ein universitäres Forschungslabor oder ein Pharmaunternehmen betreiben, das neue Medikamente testet, ein zuverlässiges Fokussierungssystem ist kein Luxus, sondern eine Notwendigkeit.
Wenn Sie auf der Suche nach einem Mikroskop-Objektträgerscanner sind und mehr darüber erfahren möchten, wie unsere Fokussierungstechnologie Ihren Anforderungen gerecht werden kann, steht Ihnen unser Team gerne zur Verfügung. Von Hellfeldscannern für die Routinediagnostik bis hin zu forschungstauglichen Fluoreszenzscannern für erweiterte Bildgebung – wir können Sie durch die Funktionen führen, die für Ihre Arbeit am wichtigsten sind. Ganz gleich, ob Sie sich für den EScan-1200 für Ihr Pathologielabor, den GScan-60 für Hochdurchsatzscans oder unsere Mehrkanal-Fluoreszenzscanner für Ihre Forschung interessieren, wir besprechen gerne mit Ihnen, wie unsere Geräte Ihren Arbeitsablauf optimieren und Ihre Ergebnisse verbessern können.
Referenzen
- Agrawal, M. & Gupta, R. (2021). Autofokus-Technologien für digitale Pathologie-Objektträgerscanner: Eine vergleichende Analyse. Journal of Pathology Informatics, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Hochpräzise Fokussierungsmechanismen für Ganzdia-Bildgebungssysteme. IEEE Transactions on Medical Imaging, 39(8), 2678-2687.
- Weltgesundheitsorganisation. (2019). Digitale Pathologie für Diagnose- und Forschungsanwendungen: Technische Spezifikationen und Best Practices. WHO Press, Genf.
